本研究探讨了人类外周血单核细胞(hPBMCs)固定化对其在阿尔茨海默病细胞模型中依赖于Аβ42聚集物的促炎状态的影响。结果显示,固定化细胞对异源刺激的基本指标水平及响应强度显著高于悬浮细胞,且β1整合素在细胞-基质粘附中起关键作用,阻断后可抑制rAβ42诱导的TNFα和Aβ40积累,提示细胞粘附因素对研究结果的重要性130。

一、研究背景与目的

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2. 阿尔茨海默病(AD)病理基础:主要与淀粉样变性和炎症相关,Aβ40和Aβ42是关键的淀粉样β肽异构体,其中Aβ42更易聚集且致病性更强2。

   
   

3. 研究意义:外周血单核细胞(PBMC)常被用于评估AD相关分子(如Aβ42)引发的细胞因子变化,但传统悬浮培养未考虑细胞粘附因素,可能与体内环境存在差异,影响研究结果12。

   
   

4. 研究目的:探究hPBMCs的细胞-基质粘附对其体外促炎状态的影响,比较悬浮细胞与固定化细胞对Aβ42刺激的响应,并分析β1整合素的作用13。

二、材料与方法

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2. 细胞来源与处理

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2. 来源:健康成年捐赠者的hPBMCs,经Ficoll–Hypaque方法分离,保存在CryoStor® CS10培养基中,细胞活力92.0%,浓度1.5×10⁶/ml456。

   
   

3. 培养方式:

   
   

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• 悬浮培养:RPMI-1640培养基(含10.0%胎牛血清等),24孔板培养24小时(37.0±0.1°C、5.0±0.1% CO₂)78。

  
  

• 固定化培养:CERO生物反应器用于固定化细胞的培养,控制培养环境参数。采用GEM技术,将细胞固定在含1.0% I型胶原蛋白、0.5% RGD肽和1.0%纤连蛋白的藻酸盐微载体表面,在生物反应器中培养24小时91011。

C

ERO3D细胞(类器官)生物反应器

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2. 实验处理

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1. 
   

2. rAβ42刺激:浓度15nM,超声处理分散聚集体后加入细胞培养体系1213。

   
   

3. β1整合素阻断:hPBMCs与抗β1整合素抗体(1:200)在37°C孵育30分钟后进行固定化培养1415。

   
   

4. 
   

5. 检测方法

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2. 细胞因子(TNFα、IL-1β)和Aβ40含量:采用ELISA试剂盒,在FL600微孔板多模式阅读器上检测,结果以ng/g总蛋白表示161718。

   
   

3. 活细胞成像:使用激光扫描共聚焦显微镜(FV10i-LIV),通过荧光探针CRANAD-2和MCAAD-3分别观察rAβ42和Aβ40的定位与积累,计算比值指数R(rAβ42/Aβ40)192021。

   
   

4. 统计分析:单因素方差分析(ANOVA)结合Tukey多重比较检验,p<0.05为差异显著22。

   
   

三、研究结果

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2. 细胞因子和Aβ40的变化

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1. 
   

2. 无rAβ42时:TNFα和Aβ40含量在24小时内无显著变化,IL-1β含量在24小时后显著降低(悬浮细胞:285.2±15.6 ng/g;固定化细胞:304.1±15.5 ng/g)232627。

   
   

3. 有rAβ42时:

   
   

• 
  

• TNFα含量增加,24小时时悬浮细胞达108.3±11.5 ng/g,固定化细胞达161.6±9.2 ng/g2627。

  
  

• Aβ40含量增加,24小时时悬浮细胞达67.5±5.1 ng/g,固定化细胞达89.2±4.2 ng/g2627。

  
  

• IL-1β未观察到积累23。

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2. 肽的定位与比值变化

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1. 
   

2. Aβ40在细胞质中积累,rAβ42在细胞膜外表面聚集24。

   
   

3. 比值指数R(rAβ42/Aβ40):悬浮细胞从0.08升至0.76,固定化细胞从0.06升至0.42,固定化细胞比值更低25。

   
   

4. 
   

5. β1整合素阻断的影响:阻断后,固定化细胞中TNFα和Aβ40的积累显著受抑制(TNFα:72.8±5.5 ng/g;Aβ40:77.9±5.5 ng/g),但仍高于悬浮细胞2829。

四、结论

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2. 固定化细胞对异源Aβ42刺激的基本指标水平及响应强度显著高于悬浮细胞30。

   
   

3. 细胞-基质粘附(由β1整合素介导)可增强hPBMCs的信号转导和合成活性30。

   
   

4. 传统悬浮培养未考虑细胞粘附因素,可能导致研究健康或AD患者来源的hPBMCs对外源性刺激的反应时得出错误结论30。

关键问题:

问题:固定化培养的hPBMCs与悬浮培养的hPBMCs对rAβ42刺激的响应存在哪些主要差异?
答案:主要差异体现在响应强度上,固定化细胞的TNFα和Aβ40积累量显著高于悬浮细胞。例如,与rAβ42孵育24小时后,固定化细胞的TNFα含量(161.6±9.2 ng/g)高于悬浮细胞(108.3±11.5 ng/g),Aβ40含量(89.2±4.2 ng/g)也高于悬浮细胞(67.5±5.1 ng/g);同时,固定化细胞的rAβ42/Aβ40比值上升幅度小于悬浮细胞,且细胞内肽的分布异质性更显著252627。

问题:β1整合素在hPBMCs的固定化效应中起到了怎样的作用?
答案:β1整合素介导了细胞与基质的粘附,对固定化hPBMCs的促淀粉样蛋白生成和促炎状态有重要影响。与β1整合素阻断抗体孵育后,固定化细胞在rAβ42处理下的TNFα和Aβ40积累显著受抑制,但仍高于悬浮细胞,表明β1整合素是细胞-基质粘附增强细胞响应的关键介质之一152829。

问题:本研究为何认为传统悬浮培养可能导致错误结论?
答案:因为悬浮培养未包含细胞通过粘附激活的因素,而细胞间及细胞-基质粘附是hPBMCs活化的关键因素,在体内始终存在。例如,单核细胞产生自由氧种类的强度受整合素粘附受体调控,且AD患者的PBMC在悬浮培养时对β-淀粉样肽刺激表现出抵抗性,忽视细胞粘附可能导致对细胞对外源性刺激的反应评估不准确230。

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